1. Introduction

La connaissance de la croissance bactérienne est d'une importance capitale tant au point de vue de la recherche fondamentale (connaissance les lois de la génétique moléculaire) que de la recherche appliquée (biotechnologie : production des médicaments, des produits alimentaires).

C'est Jacques MONOD, lauréat en 1965 du Prix Nobel de médecine (avec André LWOFF et François JACOB) qui le premier a étudié la croissance bactérienne.

La nutrition des bactéries fait intervenir deux types de substances : les substances élémentaires (les matériaux de base de constitution de la cellule) et les substances énergétiques qui fournissent l'énergie nécessaire pour que la bactérie synthétise ses propres constituants.

La croissance bactérienne aboutit, non pas à une augmentation de la taille comme chez les organismes pluricellulaires, mais à une augmentation du nombre de cellules. La plupart des bactéries se reproduisent par fission binaire ou scissiparité : une cellule donne deux cellules. Seuls quelques types de bactéries se reproduisent différemment par bourgeonnement, par fragmentation ou par sporulation.

 

2. Les besoins nutritionnels des bactéries et leur classification

Toutes les bactéries ont besoin d'eau, d'une source de carbone (C), d’oxygène (O), d’hydrogène (H), d'azote (N), de soufre (S) et de phosphore (P) qui sont les constituants des glucides, lipides, protéines et des acides nucléiques (C, O, H, N, S et P sont des macro-éléments ou macronutriments) ; des ions (K+, Na+, Ca++, Mg++, Fe++, Cl-, ...) et d'une source d'énergie.

2.1 La source d'énergie

On distingue deux catégories de bactéries selon la source d'énergie qu'elles utilisent :

- les micro-organismes phototrophes (ou photosynthétiques) qui utilisent la lumière. Parmi celles-ci, on distinguera les photolithotrophes lorsqu'elles se développent dans un milieu exclusivement minéral et les photoorganotrophes lorsqu'elles se multiplient dans un milieu organique.

- les micro-organismes chimiotrophes (ou chimiosynthétiques) qui utilisent l'oxydation des produits chimiques organiques ( il s'agira alors de chimiorganotrophes).

2.2 Les éléments chimiques indispensables

La source de carbone : le carbone est un élément essentiel de la cellule bactérienne (comme de toutes les autres cellules). Certaines bactéries utilisent le gaz carbonique (CO2 ) comme seule source de carbone : il s'agit d'organismes autotrophes. D'autres bactéries se développent dans un milieu qui contient des composés organiques carbonés : ce sont des hétérotrophes.

La source d'azote : l'azote est un élément de constitution des protéines. Quelques rares types de bactéries sont capables de fixer l'azote moléculaire atmosphérique (N2 ) ( ex : Rhizobium qui vit en symbiose avec certaines légumineuses. La plupart du temps, l'azote est incorporé sous forme de nitrites (NO2- ) (ex : Nitrobacter), de nitrates (NO3- ), d'ammoniac (NH3 ) ou de sels d'ammonium (NH4+ ), quelquefois sous forme de composés organiques appelés des composés aminés (R-NH2 ).

Les sources de soufre et de phosphore : le soufre est incorporé sous forme de sulfate (SO42-) ou de composés soufrés organiques. Le phosphore est utilisé sous forme de phosphate inorganique (HPO42 - ).

Les autres éléments minéraux : il s'agit de métaux, comme le fer ou d'ions comme les ions de sodium (Na+), potassium (K+), magnésium (Mg2+ ), chlorure (Cl- )....

Il faut également des éléments en traces appelés des oligo-éléments (manganèse : Mn, molybdène : Mo, cuivre : Cu, cobalt : Co ...). Ces éléments sont toxiques lorsqu’ils sont en quantité importante dans les milieux de croissance des micro-organismes.

2.3 Les facteurs physiques

Ils peuvent influencer le développement et la vitesse de croissance des cultures bactériennes.

La température :
Selon la température optimale de développement, on distingue :

- les mésophiles (Tmax de croissance 20 à 40°C)

- les psychrophiles (Tmax de croissance environ 0°C)

- les thermophiles (Tmax de croissance 45 à 60°C)

On a observé que les micro-organismes peuvent se développer à des températures entre -20°C à plus de 100°C. En général l’intervalle de température permettant la croissance des bactéries est de l’ordre de 30 degrés.

Les espèces qui ont une gamme étroite de température de croissance sont appelées les sténothermes, par contre d’autres espèces se développent dans une gamme de température très large : eurythermes.

Certaines bactéries (archaebactéries) peuvent croître à des températures supérieures à 100°C ou à des températures très basses.

Le pH :

Le pH optimum de croissance est variable suivant les souches. Les bactéries qui se développent préférentiellement à pH acide sont des acidophiles. Celles qui se multiplient à pH alcalin sont des basophiles. Un bon nombre croissent en milieu neutre. La gamme de tolérance pour le pH peut être large. Par exemple, pour E coli, le pH peut aller de 4,4 à 8.

L'oxygène :

Certaines bactéries ont absolument besoin d'oxygène; ce sont des aérobies strictes. D'autres ne peuvent se développer qu'en absence d'oxygène, ce sont des anaérobies strictes. D'autres sont aérobies facultatives (ou aéro-anaérobies), elles peuvent se multiplier en absence ou en présence d'oxygène.

La pression osmotique :

Du fait de l'existence de leur paroi, les bactéries sont peu sensibles aux variations de pression osmotique. Mais quand la paroi est détruite, on peut faire éclater les bactéries en les mettant dans un milieu hypotonique, c'est à dire de pression osmotique plus faible que celle du cytoplasme.

Certains archaebactéries (parce qu'elles n'ont pas le même type de paroi) sont sensibles à l'abaissement de la pression osmotique. Il s'agit des bactéries halophiles qui ne peuvent croître que dans des milieux salins très concentrés.

2.4 Distinction des différents types de bactéries suivant leurs besoins nutritionnels

SOURCE de carbone

Dioxyde de Carbone

Composés organiques

 

AUTOTROPHES

HETEROTROPHES

ENERGIE

Lumière

(préfixe = photo)

Oxydoréduction

(préfixe = chimio)

Lumière

(préfixe = photo)

Oxydoréduction

(préfixe = chimio)

SOURCE d'ELECTRONS

Substances minérales oxydables (litho)

Substrats organiques oxydables(organo)

 

Photolithotrophes

Chimiolithotrophes

photoorganotrophes

Chimio-Organotrophes

3. Techniques de mesure de la croissance bactérienne

Chez les micro-organismes, la croissance se traduit par une augmentation du nombre d’individus. Cette augmentation du nombre provient de la division d’une cellule en deux nouvelles cellules.

3.1 Comptage du nombre de cellules

Cette opération se fait manuellement à l’aide d’un microscope (chambre de comptage de Petroff-Hausser) ou à l’aide des compteurs électroniques (si les cellules sont suffisamment grandes (taille des protozoaires, algues, globules rouges ect. ,,,) tels que les compteurs de Coulter.

Au microscope, on compte les bactéries dans les grilles de la cellule de Petroff

 

3.2 Mesure de la biomasse par :

1. Détermination du poids sec : on prélève un certain volume de suspension bactérienne et on laisse sécher à 110°C pendant 12h puis on pèse l'échantillon sec.

2. Opacimétrie : on mesure la turbidité de la suspension bactérienne à l’aide d’un turbidimètre ou colorimètre (à longueur d’onde > 650 nm)

 

3. Détermination d’un des constituants cellulaires : en général, on mesure la quantité de protéines ou de chlorophylle.

4. Culture bactérienne

On trouve les micro-organismes partout où il y a disponibilité de nutriments et d’énergie c’est à dire presque partout sur la terre. Chez l’homme, par exemple, on peut trouver plus de micro-organismes que de cellules des organes. Les différentes espèces se développent suivant les disponibilités en nutriments et suivant les facteurs physiques qui sont favorables à leur croissance. Si on veut étudier les propriétés des bactéries, on est obligé de les cultiver c’est à dire de les faire croître en dehors de leur milieu naturel. Il faut dans ces conditions connaître leurs besoins nutritionnels (milieux de culture) ainsi que les paramètres physiques de croissance (température, pression osmotique, avec ou sans oxygène ect...). Ces connaissances sont encore très empiriques car on ne connaît pas encore tous les propriétés des micro-organismes.

4.1 Les facteurs chimiques de croissance

Les besoins nutritifs des bactéries sont très différents d’une espèce à l’autre. De plus, ces besoins peuvent changer au sein d’une même espèce, suite à des mutations génétiques. Les prototrophes sont peu exigeants, ils peuvent se multiplier dans des milieux simples appelés milieux minimaux (milieux ne contenant pas de composés organiques autres qu’une source de carbone (ex : glucose, lactate ...). On appelle par contre auxotrophe un prototrophe qui a subit une mutation qui l’empêche de synthétiser une molécule essentielle à sa croissance. La molécule essentielle qu’on doit ajouter dans le milieu pour que les auxotrophes puissent croître est appelée facteur chimique de croissance. Par exemple, une souche bactérienne ayant subit une mutation capable de bloquer la synthèse de la leucine ne se développera pas en absence de leucine. La leucine devient pour cette souche une facteur chimique de croissance. La souche bactérienne est dite souche auxotrophe pour la leucine et le symbole génétique pour désigner cette souche bactérienne est : leu + . La souche prototrophe (les bactéries qui n’ont pas subit la mutation) sera noté leu -.

4.2 Les différentes techniques de culture et les milieux de culture

Suivant les besoins de l’étude, on peut cultiver les micro-organismes :

- soit  sur des supports solides (culture en milieu solide) on utilise en général la gélose ou l’agar -agar comme support solide.

- soit en suspension dans l’eau (culture en milieu liquide). Les cultures en milieu liquide peuvent se faire de manière continue (c’est à dire qu’on fournit continuellement des nutriments et qu’on élimine aussi continuellement les déchets) ou manière discontinue ou non renouvelée (c’est à dire en milieu clos).

Quel que soit le mode de culture que l’on pratique, il est nécessaire de fournir aux micro-organismes des nutriments indispensables. Le milieu nutritif utilisé est appelé milieu de culture. Suivant les espèces, les milieux de culture sont des mélanges de substances plus ou moins complexes. On distingue des milieux synthétiques ou définis lorsqu’on connaît exactement la nature chimique des constituants. Les milieux sont dits complexes lorsque les produits qui composent le milieu ne sont pas bien connus : milieu contenant par exemple des peptones ( hydrolysat de protéines venant de la viande , du lait , du soja...), du sang ou sérum, un extrait de viande, un extrait de levure ect..

Remarque : Les besoins en facteurs de croissance sont parfois satisfaits par la présence d'une autre espèce qui elle-même synthétise ledit facteur. Ce phénomène d'interaction métabolique est connu sous le nom de syntropie.

4.3 Maximum de croissance

Dans les cultures en milieu non renouvelé, le nombre maximum de bactéries obtenues dans un milieu donné est déterminé par différents facteurs :

a - Epuisement en éléments nutritifs essentiels,

b - Variation du pH jusqu'à des valeurs extrêmes,

c - Accumulation des produits de déchet du métabolisme, ce qui, avec la valeur du pH du milieu, peut être toxique pour les cellules et empêcher leur croissance.

Si les facteurs b (pH)et c (déchets) ne sont pas importants et si les concentrations en éléments nutritifs essentiels sont en excès par rapport à celle d'un nutriment donné, alors il existe une relation linéaire entre la population de la phase stationnaire et la concentration du nutriment considéré. Ceci est représenté par la figure où la linéarité finit quand les facteurs autres que la concentration en nutriment limitent la croissance.

 

4.4 Diauxie

Dans certaines conditions, on peut observer des courbes de croissance plus complexes, avec souvent deux phases de croissance exponentielle séparées par une phase de latence. Cette croissance biphasique ou "diauxie", ou croissance double, est observée avec certaines bactéries poussant dans un milieu limitant en deux sucres ou en un sucre et un acide organique. La première phase de croissance correspond à l'utilisation exclusive d'un des composés, elle est suivie d'une période d'adaptation et d'une deuxième phase de croissance où le deuxième composé est métabolisé. La figure est une courbe de diauxie typique où les deux substrats sont le glucose et l'acide citrique.

5. Loi de la croissance bactérienne en milieu non renouvelé

5.1 Le cycle de la croissance bactérienne en milieu non renouvelé

Si l'on introduit un certain nombre de bactéries vivantes dans un volume donné de milieu nutritif contenu dans un système fermé (comme un flacon), leur croissance peut être divisée en différentes phases caractéristiques :

a - La phase de latence, avant le début des divisions cellulaires.

b - La phase d'accélération (pour certaines espèces cette phase n’est pas décelable)

c - La phase exponentielle, ou phase de croissance logarithmique, durant laquelle les cellules se divisent à vitesse constante et maximale.

d - La phase de décélération

e - La phase stationnaire, lorsque cessent les divisions cellulaires.

f - La phase de dégénérescence des bactéries (mort des bactéries)

La croissance bactérienne est limitée dans le temps quand on ne renouvelle pas le milieu nutritif. Le milieu finit par s'épuiser et les bactéries meurent.

5.2 Loi de la croissance bactérienne en milieu non renouvelé

Si N est le nombre de bactéries, dN représente l’accroissement de la population pendant un temps dt. On peut admettre  que dN dépend de N, de dt, de l’espèce et des conditions de la culture. Le facteur de proportionnalité m représente les paramètres de conditions de culture et l'espèce.

La loi de l'accroissement de la population bactérienne (le nombre N d'individus) s'exprime par la relation :

dN = N m dt (1)

N0 est le nombre de bactérie au départ, m s'appelle vitesse spécifique de croissance, dt est le temps nécessaire pour que se forme dN bactéries en plus.

Si m est égal à zéro, dN est nul c'est à dire N ne varie pas (partie "a" de la courbe).

Si m est constant, différent de zéro et positif ( partie c de la courbe), on est en phase exponentielle de croissance.

Si on examine une cellule, on peut voir son volume augmenter jusqu'à la division en deux cellules-filles qui, à leur tour augmentent de volume et se divisent en deux. Le temps entre deux divisions est appelé : temps de génération.

Du fait que :

a - le temps de division de chaque bactérie est différent

b - toutes les bactéries ne se divisent pas au même moment

c - la culture bactérienne met en jeu beaucoup de cellules,

le temps de génération qu’on observe représente un temps moyen : c'est le temps de génération moyen G.

Si on met No cellules dans milieu nutritif, au bout de 1 temps de génération (1 génération) on aura 2No cellules, au bout de 2 temps de génération (2 générations) 4No cellules (22 No cellules) et de x générations 2x No cellules.

Soit N le nombre de bactéries après x générations :

N = No . 2x (4) d'où Ln N = Ln No + x Ln 2 (5)

Soit G le temps de génération moyen et t le temps pour que No bactéries deviennent N bactéries :

t / G = x (7) (le nombre de générations)

En remplaçant x par t / G dans l'équation , on obtient :

t/G = x = (Ln N - Ln No) / (Ln 2) (8)

En appliquant les relations (3) et (8) on déduit que t/G = mt / Ln 2 (9)

et on donc tirer la relation : G = ( Ln 2) / m (10)